Рис. 1. Организатор Шпемана—Мангольд. Вверху: схема знаменитого эксперимента Ханса Шпемана и Хильды Мангольд. Участок дорсальной (dorsal), то есть спинной, губы бластопора гаструлы тритона (donor embryo), пересадили в другую гаструлу — реципиента. В результате у реципиента сформировалась дополнительная ось тела: сначала появилась лишняя нервная пластинка, а затем и целый лишний тритончик. Получились «сиамские близнецы». Дополнительный тритон сформировался не только и не столько из пересаженных клеток эмбриона-донора, сколько из клеток реципиента, судьба которых в норме должна была быть совершенно иной. Внизу слева — результат такого же эксперимента на шпорцевой лягушке. Внизу справа — упрощенная схема работы шпемановского организатора. Сигнальный каскад с участием секретируемого клетками белка Wnt и внутриклеточного регулятора транскрипции белка β-catenin заставляет клетки организатора производить «дорзализующие факторы» (белки Noggin, Chordin и др.), которые нейтрализуют действие «вентрализующих факторов» (BMP4). В результате эктодермальные клетки рядом с организатором начинают превращаться в нервную пластинку, а те, что расположены далеко от него, под действием вентрализующих факторов становятся клетками кожи и других тканей. Изображения из работ E. M. De Robertis и его коллег
В онтогенезе позвоночных ключевую роль играет «организатор Шпемана—Мангольд» — группа клеток, расположенная у спинного края бластопора на стадии гаструлы. Организатор производит сигнальные белки, организующие поведение других эмбриональных клеток таким образом, чтобы из них в итоге получился нормальный организм. Пересадка фрагмента организатора в произвольное место другого эмбриона приводит к формированию дополнительной оси тела (получаются «сиамские близнецы»). Эксперименты на эмбрионах актинии Nematostella показали, что у этого представителя низших многоклеточных край бластопора тоже является осевым организатором, причем в основе его работы лежит активность того же сигнального каскада, что и у позвоночных (Wnt/β-catenin). Наряду с имеющимися (довольно отрывочными) данными по работе организаторов у других беспозвоночных обнаруженные факты свидетельствуют о том, что бластопоральный осевой организатор — древняя структура, существовавшая уже у общего предка книдарий и билатерий.
Открытие Ханса Шпемана (Hans Spemann) и Хильды Мангольд (Hilde Mangold), показавших, что небольшой участок гаструлы (дорзальная губа бластопора) фактически заставляет окружающие клетки организоваться в сложный целостный организм (рис. 1), стало поворотной точкой в развитии эмбриологии. Этот эксперимент приоткрыл завесу тайны над фундаментальными принципами онтогенеза многоклеточных (см.: Как клетки понимают, что одни должны стать волосами, другие костями, третьи мозгами и т. п.?) и наметил направления дальнейших исследований, которые в итоге породили современную эволюционную биологию развития (evolutionary developmental biology, evo-devo).
Ключевую роль в формировании и работе шпемановского организатора играет сигнальный каскад Wnt/β-catenin (см. Wnt signaling pathway). Чтобы создать полноценный эктопический (то есть находящийся в неположенном месте) организатор, способный обеспечить формирование дополнительной оси тела, достаточно активировать в каком-нибудь бластомере несколько генов — компонентов каскада Wnt/β-catenin (в случае шпорцевой лягушки Xenopus это гены Wnt-1, Xwnt-8, dishevelled, β-catenin) — и отключить один ген, подавляющий работу каскада (GSK3β).
Бластопоральный осевой организатор был открыт и наиболее подробно изучен у амфибий. При этом его эволюционное происхождение долгое время оставалось неясным. Является ли его наличие уникальной чертой позвоночных? Или гомологичные эмбриональные структуры есть и у других животных, и тогда момент появления бластопорального организатора следует отодвинуть дальше в прошлое — может быть, к общим предкам всех вторичноротых, билатерий, Eumetazoa или вообще всех животных?
Существование осевых организаторов — групп клеток, пересадка которых индуцирует развитие дополнительных осей тела, — ранее было продемонстрировано у целого ряда беспозвоночных: морских ежей, мечехвостов, пауков, кольчатых червей, гидроидных полипов и других. Но нет твердой уверенности, что эти осевые организаторы гомологичны организатору Шпемана—Мангольд. В принципе организаторы могли возникать независимо в разных эволюционных линиях, а работа их гипотетически может быть основана на разных сигнальных каскадах, которые в ходе эволюции привлекались («кооптировались») для выполнения схожих функций.
Например, показано, что приротовой конус (гипостом) взрослой пресноводной гидры, если пересадить его в стенку тела другого полипа, индуцирует формирование дополнительной оси тела — полипа-близнеца. Таким образом, гипостом гидры является осевым организатором. Однако он отличается от шпемановского организатора как минимум тем, что работает на стадии взрослого организма, а не гаструлы, и прилегает не к бластопору, а ко рту взрослой особи. Гаструляция у гидры происходит таким образом, что бластопор как таковой вообще не формируется (способы гаструляции книдарий крайне разнообразны, см.: Юлия Краус. Гаструляция книдарий: ключ к пониманию филогенеза или хаос вторичных модификаций?). Кроме того, молекулярные основы работы осевого организатора гидры известны лишь в общих чертах (показано, что его работа связана с каскадом Wnt/β-catenin, но подробности неизвестны).
Более удобным объектом для выяснения вопроса о том, есть ли у низших многоклеточных бластопоральный осевой организатор, гомологичный организатору Шпемана—Мангольд, является актиния Nematostella (см.: Геном актинии оказался почти таким же сложным, как у человека, «Элементы», 11.07.2007). У нее, в отличие от гидры, гаструляция инвагинационная (происходит путем впячивания), и поэтому имеется хорошо выраженный бластопор.
Юлия Краус с кафедры биологической эволюции биофака МГУ и ее коллеги из Венского университета ранее показали, что у актинии пересадка фрагмента губы бластопора (но не других частей эмбриона) вызывает формирование эктопической оси тела, то есть актинии-близнеца. Таким образом, у нематостеллы, как и у позвоночных, есть бластопоральный осевой организатор (Y. Kraus et al., 2007. The blastoporal organiser of a sea anemone).
В новой статье, опубликованной в журнале Nature Communications, Краус и ее коллеги сообщают о результатах дальнейших исследований этого организатора, показавших, что не только общие свойства и расположение, но и молекулярные основы его работы сходны с таковыми у позвоночных.
Предварительные опыты показали, что искусственная активация сигнального каскада Wnt/β-catenin может приводить к формированию дополнительных осей тела (для этого авторы при помощи системы CRISPR/Cas9 выводили из строя ген APC, подавляющий работу каскада Wnt/β-catenin). Значит, данный каскад с большой вероятностью действительно как-то связан с работой организатора. Теперь нужно было разобраться в деталях.
В геноме актинии имеется целых 13 генов, кодирующих разные версии внеклеточного сигнального белка Wnt. На стадии гаструлы они экспрессируются в разных частях эмбриона. Поскольку свойствами осевого организатора обладает только губа бластопора, авторы сосредоточились на пяти из них: Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt4 и WntA. Зоны экспрессии этих генов на стадии средней гаструлы имеют вид концентрических, частично перекрывающихся колец вокруг бластопора. Чтобы еще сильнее сузить круг поиска, авторы провели серию экспериментов по трансплантации (рис. 2). Это позволило установить, что наиболее выраженной организующей способностью обладают клетки, расположенные на изгибе губы бластопора (сектор 2 на рис. 2). В этой зоне экспрессируются Wnt1, Wnt3, WntA и, возможно, Wnt4, но не Wnt2. Таким образом, осталось четыре «подозреваемых».
Рис. 2. Эксперименты по точной локализации участка губы бластопора, индуцирующего формирование дополнительной оси тела. Слева — схема эксперимента, справа — результаты. Фрагмент одного из четырех секторов губы бластопора пересаживался на аборальную сторону другой гаструлы (слева вверху). Это приводило к одному из трех результатов: либо развивался нормальный полип без дополнительных осей (этот вариант на рисунке обозначен светло-зеленым цветом), либо формировался недоразвитый дополнительный полип (рыжий цвет), либо развивалась полноценная вторая ось тела (красно-коричневый цвет). Диаграмма справа показывает, что второй из четырех секторов губы бластопора индуцирует развитие лишней оси тела наиболее эффективно. Красными стрелками на фотографиях показаны глотки полипов. На рисунках, изображающих поперечный срез гаструлы, серым цветом обозначена эктодерма, голубым — эндодерма. Изображение из обсуждаемой статьи в Nature Communications
Авторы изготовили плазмиды, содержащие каждый из четырех генов-кандидатов, и стали инъецировать их в клетки эмбрионов. Выяснилось, что экспрессия WntA и Wnt4 не ведет к формированию лишних осей тела, тогда как экспрессия Wnt1 и Wnt3 иногда стимулирует развитие частично сформированных дополнительных полипов.
Самым мощным организующим действием обладает совместная экспрессия Wnt1 и Wnt3. Если эти гены работают вместе в одном и том же участке эмбриона, то дополнительная ось тела формируется в 50% случаев, а многие из образовавшихся лишних полипов оказываются полностью развитыми. Пересадка клеток с искусственно вызванной эктопической экспрессией этих генов работает так же, как и пересадка фрагментов сектора 2 губы бластопора, то есть такие клетки приобретают свойства осевого организатора.
Эти результаты показывают, что формирование «головы» (орального конца тела) у нематостеллы действительно индуцируется сигнальным каскадом Wnt/β-catenin, причем Wnt1 и Wnt3 совместными усилиями придают организующие свойства эмбриональным клеткам.
Дополнительные эксперименты подтвердили этот вывод. В частности, авторы обрабатывали ранние эмбрионы актинии веществом AZK (1-Azakenpaullone), которое неизбирательно активирует каскад Wnt/β-catenin во всех клетках (рис. 3, вверху). Это привело к радикальной «орализации» эмбрионов. Иными словами, у них не формировался нормальный аборальный конец тела (который у взрослого полипа становится «ножкой»), а вместо этого вся аборальная сторона покрывалась складками и мелкими отверстиями, как будто эмбрион пытался наделать себе ртов повсюду (рис. 3).
Рис. 3. Искусственное усиление передачи сигнала по каскаду Wnt/β-catenin приводит к «орализации» эмбрионов. Слева — упрощенная схема каскада Wnt/β-catenin. Внеклеточный сигнальный белок Wnt взаимодействует с рецептором Fz. Это приводит к инактивации комплекса белков, включающего белок GSK3β. Этот комплекс, будучи в рабочем состоянии, инактивирует белок β-catenin. Освободившись от гнёта GSK3β и его сообщников, бета-катенин отправляется в ядро, где, через ряд промежуточных этапов, запускает экспрессию подконтрольных генов (Target genes). Вещество AZK блокирует работу GSK3β, что ведет к усиленному поступлению бета-катенина в ядро даже без внешней «команды», подаваемой белком Wnt. j, k — эмбрион актинии после обработки веществом AZK, через 72 часа после оплодотворения. j — его оральная сторона (виден бластопор), k — аборальная сторона, испещренная складками и мелкими отверстиями. l — нормальная личинка актинии (планула) через 72 часа после оплодотворения, вид сбоку. У нее есть рот (бывший бластопор) на оральном конце (отмечен звездочкой) и нормальная, гладкая аборальная сторона с пучком ресничек (апикальным органом) на вершине. Изображение из обсуждаемой статьи в Nature Communications
Кроме того, обработка веществом AZK приводит к тому, что кольца экспрессии некоторых генов Wnt (а именно Wnt1, Wnt2 и Wnt4) отодвигаются от бластопора и смещаются в аборальном направлении. По-видимому, это значит, что в регуляции сигнальных каскадов c участием Wnt задействованы отрицательные обратные связи: слишком интенсивная передача сигнала (когда много бета-катенина поступает в ядро) тормозит производство некоторых белков Wnt. Так или иначе, у эмбрионов, обработанных AZK, область совместной экспрессии генов Wnt1 и Wnt3 оказывается уже не около бластопора, а на аборальной стороне. В соответствии с этим, клетки губы бластопора, взятые у таких эмбрионов, при пересадке уже не способны индуцировать дополнительные оси тела у эмбрионов-реципиентов. Зато эту способность приобретают аборальные клетки эмбрионов, обработанных AZK, — те самые клетки, в которых наблюдается совместная экспрессия Wnt1 и Wnt3.
Дополнительные эксперименты также показали, что на более ранних этапах развития Wnt1, Wnt3 и WntA экспрессируются в клетках пре-эндодермальной пластинки (которая затем, в ходе гаструляции, впячивается внутрь и дает начало эндодерме). Возможно, эти гены сначала участвуют в дифференцировке будущей эндодермы, а потом, отслужив эту службу, приступают к следующей. Область их экспрессии расползается в стороны от эндодермы и приобретает вид кольца вокруг бластопора. Это кольцо и становится осевым организатором.
Авторы также изучили работу многих других генов на разных этапах эмбрионального развития актинии. Это позволило обнаружить дополнительные черты сходства между бластопоральными осевыми организаторами актинии и позвоночных.
У позвоночных шпемановский организатор участвует в формировании как передне-задней полярности (ключевую роль в этом играет Wnt-каскад), так и спинно-брюшной (дорзо-вентральной). В шпемановском организаторе бета-катениновый сигнал запускает синтез «дорзализующих факторов» (антагонистов BMP), таких как chordin (рис. 1); та сторона тела, где воздействие BMP на клетки эктодермы подавляется этими белками, становится спинной. У радиально-симметричных книдарий, таких как гидра, ось тела только одна — орально-аборальная. Она соответствует, судя по всему, передне-задней оси билатерий. Но у класса Anthozoa (коралловые полипы), к которому относится актиния, есть также и вторая ось тела — «директивная ось». Возможно, она гомологична дорзо-вентральной оси билатерий, поскольку ключевую роль в ее формировании играют гены Dpp и Chd, гомологичные генам bmp4 и chordin позвоночных. Сначала Dpp и Chd экспрессируются равномерно вокруг бластопора, а затем, на стадии поздней гаструлы, зона их экспрессии становится асимметричной. Эта асимметрия и задает директивную ось. Результаты, полученные авторами, свидетельствуют о том, что формирование директивной оси, основанное на работе BMP-каскада, на ранних этапах контролируется сигнальной системой Wnt/β-catenin, но потом становится независимым от Wnt. Это очень похоже на то, что наблюдается у позвоночных.
Таким образом, у актинии Nematostella, представителя «низших многоклеточных», имеется бластопоральный осевой организатор, сходный со шпемановским организатором позвоночных не только в общих чертах, но и во многих деталях. Это — серьезный довод в пользу гомологии (общего происхождения) этих эмбриональных структур. По-видимому, осевой организатор, тесно связанный с бластопором, имелся уже у общего предка книдарий и билатерий. Получается, что базовый механизм формирования полярности и осей тела, возможно, сложился еще на заре эволюции животного царства, а в дальнейшем подвергался разнообразным модификациям в разных эволюционных линиях.
Источник: Yulia Kraus, Andy Aman, Ulrich Technau & Grigory Genikhovich. Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer // Nature Communications. 2016. V. 7. Article number: 11694.
См. также об организаторах и функциях Wnt/β-catenin:
1) Развитие червей начинается с хвоста, «Элементы», 23.11.2006.
2) Разгадан механизм регенерации конечностей, «Элементы», 27.11.2006.
3) Белок–регулятор индивидуального развития управляет движением раковых клеток, «Элементы», 18.04.2008.
4) Генетические механизмы формирования сложных признаков постепенно проясняются, «Элементы», 14.04.2010.
5) Планария — модельный объект для изучения регенерации у многоклеточных, «Элементы», 16.05.2011.
6) Развивающиеся части спинного мозга сначала регулируются централизованно, а затем переходят на самоуправление, «Элементы», 01.10.2014.
7) Длинные плавники скатов — результат добавления новой точки роста, «Элементы», 22.12.2015.
Александр Марков, Юлия Краус
Амазахи — белый север Африки 
Как нарастить ресницы самостоятельно – инструкция