Рис. 1. Схема метода «непрерывной эволюции при помощи фагов» (Phage-assisted continuous evolution, PACE), позволяющего получить белок с требуемыми свойствами. В клетку кишечной палочки (Host E. coli cell) добавляют две плазмиды (маленькие кольцевые хромосомы): МP (mutagenesis plasmid) и AP (accessory plasmid). Первая служит для регуляции скорости мутагенеза. Вторая содержит ген (M13 gene III), кодирующий белок pIII, который необходим для размножения вируса-бактериофага (SP, selection phage). Чтобы включить этот ген, в клетке должен находиться белок («эволюционирующий белок», evolving protein), способный связываться с «мишенью» (target) — например, другим белком. Ген эволюционирующего белка (Evolving gene) находится в геноме вируса, которым заражают популяцию бактерий. В такой ситуации размножиться удается только тем вирусам, чей «эволюционирующий ген» кодирует белок, достаточно эффективно связывающийся с мишенью. Эволюция происходит в проточной системе, куда постоянно добавляются новые бактерии (Constant inflow). Скорость потока отрегулирована таким образом, чтобы вирусы успевали размножиться до того, как будут вымыты из резервуара, а бактерии — не успевали. Поэтому эволюционировать могут только гены, находящиеся в геноме вируса. Прочие пояснения в тексте. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature
Генетически модифицированные растения, защищенные от насекомых-вредителей безвредными для других животных бактериальными токсинами, позволяют резко увеличить урожайность, но ненадолго: насекомые быстро приспосабливаются к токсинам. Чтобы на равных участвовать в эволюционной гонке вооружений с вредителями, необходимо научиться разрабатывать новые токсины, обладающие таким же узким действием. Американские биоинженеры придумали методику, позволяющую в кратчайшие сроки получать новые токсины, опасные только для определенной группы насекомых. Методика основана на быстрой эволюции вирусов-бактериофагов, сконструированных таким образом, чтобы для выживания им был необходим белок, обладающий нужными человеку свойствами.
Использование генетически модифицированных растений в сельском хозяйстве неуклонно ширится, несмотря на сохраняющуюся кое у кого предвзятость и необоснованные страхи (см.: Александр Панчин. Сумма биотехнологий). На сегодняшний день одним из самых простых и многообещающих подходов к повышению урожайности является внедрение в геном растений генов почвенной бактерии Bacillus thuringiensis, кодирующих белковые токсины, опасные только для определенных групп насекомых и больше ни для кого. Эти токсины, обобщенно называемые Bt-токсинами, связываются с рецепторами на поверхности клеток средней кишки насекомого и способствуют образованию дыр в клеточных мембранах, что приводит к гибели клеток, а затем и всего насекомого. Каждый Bt-токсин распознает только «свой» рецептор и поэтому безопасен для животных, у которых такого рецептора нет.
ГМ-растения со встроенными генами Bt-токсинов используются в сельском хозяйстве уже около 20 лет. На сегодняшний день ими засеяно 420 млн га. Их использование существенно повысило продуктивность сельскохозяйственного производства (см.: Трансгенный хлопок помог китайским крестьянам победить опасного вредителя, «Элементы», 20.09.2008).
Однако насекомые быстро приспосабливаются практически к любым ядам, в том числе и к Bt-токсинам. Устойчивые насекомые начинают появляться всего через 5–6 лет после внедрения нового трансгенного сорта, а иногда еще быстрее. Чтобы не проиграть в эволюционной гонке вооружений, необходимо развивать «прикладную эволюционную биологию» (см.: Насекомые-вредители защищаются от биологического оружия, «Элементы», 08.10.2007).
Уже разработано несколько стратегий, позволяющих замедлить распространение устойчивости в популяциях вредителей. Один из подходов — засеивать небольшие участки незащищенными растениями, чтобы на этих участках отбор благоприятствовал насекомым, не имеющим средств защиты от яда. Дело в том, что выработка устойчивости к яду как правило (хотя и не всегда) сопровождается негативными побочными эффектами, поэтому в конкуренции за не отравленные растения устойчивые насекомые проигрывают неустойчивым. Но это требует от фермеров определенного уровня грамотности и даже альтруизма: не каждый согласится превратить часть своего надела в питомник для вредителей. Другой подход — заставить растение производить сразу несколько разных токсинов, направленных против одних и тех же вредителей. Наконец, можно просто почаще менять токсины. Но где взять столько разных токсинов, каждый из которых к тому же должен обладать узконаправленным действием и не вредить никому, кроме определенной группы насекомых?
Американские биоинженеры из Гарвардского и Корнелльского университетов и компании Монсанто опубликовали в журнале Nature статью, в которой они описывают новый хитроумный метод, позволяющий при помощи искусственной эволюции быстро получать новые модификации Bt-токсинов с требуемыми свойствами.
На поверхности клеток кишечника насекомых имеется много потенциальных мишеней для Bt-токсинов (различных белковых рецепторов), но далеко не все они используются существующими в природе Bt-токсинами. Следовательно, можно попытаться изменить ту часть аминокислотной последовательности токсина, которая служит для распознавания рецептора-мишени, так, чтобы токсин начал связываться с каким-нибудь другим рецептором. В остальном токсин можно оставить без изменений. В результате мы, возможно, получим новый токсин, который будет так же эффективно разрушать мембраны клеток кишечника, но прикрепляться он будет к другим поверхностным белкам этих клеток. Известно, что устойчивость насекомых к Bt-токсинам обычно развивается за счет мутаций, меняющих соответствующий поверхностный белок или вовсе отключающих его экспрессию (без многих белковых рецепторов прожить можно, а вот с продырявленными клетками кишечного эпителия — нельзя). Таким образом, изменив специфичность токсина (заставив его распознавать другой рецептор), можно преодолеть выработанную насекомыми устойчивость.
Но как изменить специфичность токсина? Для этого требуется не одна и не две, а много аминокислотных замен. К сожалению, современные знания о связи аминокислотной последовательности белка с его функциональностью по-прежнему недостаточны, чтобы просто взять и спроектировать нужный белок на бумаге или компьютере. Поэтому наилучшим методом остается «дарвиновская эволюция в пробирке», то есть случайные мутации и отбор. Природа ведь тоже не смогла изобрести ничего лучшего. Тот же общий принцип использует и иммунная система позвоночных для выработки специфических антител, избирательно связывающихся с определенным антигеном (см.: Мутагенез в лимфоцитах — результат целенаправленного изменения ДНК и последующей «неточной починки», «Элементы», 03.09.2007).
Чтобы получить новые токсины, авторы модифицировали недавно изобретенную технологию «непрерывной эволюции при помощи фагов» (phage-assisted continuous evolution, PACE, см.: Kevin M. Esvelt, Jacob C. Carlson & David R. Liu, 2011. A system for the continuous directed evolution of biomolecules). Суть метода PACE в том, что в бактерию вставляют маленькую дополнительную хромосому (плазмиду, на рис. 1 она обозначена буквами AP), содержащую ген вирусного белка pIII (M13 gene III). Этот белок необходим для размножения вируса-бактериофага. При этом регуляторную область данного гена конструируют таким образом, чтобы ген включался только при наличии в клетке белка, обладающего определенными свойствами (Evolving protein на рис. 1). Затем бактерий заражают бактериофагами (SP), не имеющими собственного гена pIII. В геном фагов вставлена генетическая заготовка: ген того самого «эволюционирующего белка», который исследователи хотят изменить путем искусственной эволюции (Evolving gene). Всё происходит в проточном резервуаре с постоянным поступлением новых бактерий, которые вымываются оттуда быстрее, чем успевают размножиться. Фаги, однако, размножаются быстрее бактерий, поэтому в системе PACE эволюционируют только вирусные гены, но не бактериальные и не плазмидные. Селективное преимущество получают те фаги, чей «эволюционирующий ген» обеспечивает наиболее эффективное производство белка pIII, закодированного в плазмиде AP. Для регуляции скорости мутагенеза в бактериальные клетки добавляется еще одна плазмида, MP. Она содержит генетическую конструкцию, которая позволяет регулировать темп мутирования, меняя концентрацию сахара арабинозы в среде.
Главное достоинство этой технологии состоит в том, что она позволяет проводить искусственную эволюцию в автоматическом режиме в течение многих поколений подряд. До сих пор разработка новых белков методом искусственной эволюции, как правило, требовала человеческого вмешательства на каждом шаге: сначала нужно размножить исходный ген, внося в него случайные мутации, затем синтезировать белки, отобрать из них лучший, отсеквенировать его ген, снова размножить его с мутациями и т. д. Процесс получался очень трудоемким, и поэтому дело чаще всего ограничивалось лишь несколькими поколениями репликаторов. Между тем для серьезных эволюционных изменений требуется, как правило, много поколений. Ранее удалось отчасти автоматизировать искусственную эволюцию рибозимов (см.: Эволюция под управлением компьютера, «Элементы», 12.04.2008), но на эволюцию белков эту технологию перенести трудно. То, что биологи теперь могут заставить вирусы — самые быстро эволюционирующие репликаторы в природе — в автономном режиме «изобретать» нужные человеку белки, это, безусловно, впечатляющее достижение.
Впрочем, система PACE до сих пор не использовалась для получения белков, избирательно связывающихся с другими белками.
Авторы поставили себе целью получить новую модификацию широко используемого в генной инженерии Bt-токсина Cry1Ac, которая связывалась бы с рецептором TnCAD бабочки металловидки серой (Trichoplusia ni, см.: Cabbage looper) — опасного вредителя. Естественный токсин Cry1Ac, имеющийся у бактерии Bacillus thuringiensis, не связывается с рецептором TnCAD, а бабочки T. ni уже успели выработать устойчивость к этому токсину.
Система PACE была модифицирована следующим образом (рис. 1). В геном бактериофага (SP) в качестве «эволюционирующего гена» вставили ген белка, представляющего собой участок токсина Cry1Ac, служащий для распознавания рецептора хозяйской клетки, к которому присоединена одна из частей (субъединиц) бактериальной РНК-полимеразы. В плазмиду AP перед геном белка pIII (который, как мы помним, необходим для размножения вируса) вставили регуляторную область, содержащую участок ДНК (синий прямоугольник на рис. 1, а), распознаваемый специальным ДНК-связывающим белком (он изображен в виде четырех синих и голубых кружочков на рис. 1, а). В плазмиде также имеется ген, кодирующий этот ДНК-связывающий белок, соединенный с «мишенью» (target) — фрагментом рецептора TnCAD бабочки-вредителя. Таким образом, чтобы запустить экспрессию pIII, белок Cry1Ac, закодированный в геноме фага, должен присоединиться к «мишени». Тогда на пришитом к нему фрагменте РНК-полимеразы соберется вся многокомпонентная бактериальная РНК-полимераза, которая окажется как раз в нужном месте, чтобы осуществить транскрипцию pIII и произвести белок, необходимый для размножения вируса. В итоге размножиться смогут только те вирусы, чей Cry1Ac хоть немного прилипает к TnCAD. Чем сильнее он будет прилипать, тем быстрее будут размножаться вирусы.
Однако рецептор TnCAD настолько мало похож на естественные мишени токсина Cry1Ac, что последний к нему вообще не прилипает, так что отбору поначалу не за что зацепиться. Попытки сразу использовать TnCAD в качестве мишени не увенчались успехом: ни один вирус не сумел размножиться. Тогда авторы изготовили «промежуточную ступеньку» для искусственной эволюции: модифицированный вариант TnCAD, в котором три аминокислоты были заменены таким образом, чтобы ключевой участок белка, распознаваемый Bt-токсинами, стал больше похож на естественные мишени Cry1Ac.
Это помогло, и за 276 часов эволюции (что соответствует такому же числу поколений фагов, поскольку смена поколений у них происходит примерно каждый час) удалось вывести несколько вариантов Cry1Ac, надежно прилипающих к модифицированному TnCAD. После этого мишень заменили на обычный TnCAD, и спустя еще 252 часа были получены варианты Cry1Ac, эффективно связывающиеся с этим рецептором.
От исходного Cry1Ac новые токсины отличаются 10–12 аминокислотными заменами. Это много: получить такие белки без помощи PACE, вручную размножая гены и отбирая белки на каждом шаге, было бы крайне трудно.
Впрочем, это была еще не окончательная победа. Полученные белки связываются с TnCAD, но сохранили ли они свою смертоносность для бабочки-вредителя? Как выяснилось, нет. Эксперименты показали, что новые белки потеряли устойчивость к пищеварительным ферментам гусеницы: они просто-напросто разрушаются в ее кишечнике и почти не оказывают токсического действия.
Данный результат был вполне ожидаемым. Ведь в ходе искусственной эволюции отбор шел только на способность Cry1Ac связываться с рецептором TnCAD, а все остальные свойства белка игнорировались. Чтобы все-таки получить эффективный токсин, авторам пришлось «отменять» закрепившиеся мутации по одной и смотреть, как это повлияет на токсичность. В итоге выяснилось, что на ранних этапах искусственной эволюции, когда в качестве мишени использовался еще не настоящий TnCAD, а его модифицированный вариант, у эволюционирующего Cry1Ac закрепились две аминокислотные замены, которые и сделали белок уязвимым для пищеварительных ферментов гусеницы. Когда исследователи убрали эти замены (то есть вернули соответствующие аминокислоты в исходное состояние), получился эффективный токсин, убивающий любых гусениц T. ni: как устойчивых к исходному Cry1Ac, так и неустойчивых. Смертоносность нового токсина по отношению к устойчивым бабочкам оказалась сопоставима с токсичностью исходного Cry1Ac по отношению к исходным бабочкам, еще не выработавшим устойчивость к Cry1Ac. Таким образом, приобретенную вредителем устойчивость удалось успешно преодолеть. Новый токсин убивает только гусениц T. ni и ряда близких видов бабочек, у которых есть похожий рецептор, но безвреден для всех остальных животных.
Исследование показало, что в вечной битве человека с насекомыми за урожай нам всё-таки есть что противопоставить быстро эволюционирующим вредителям. Поставив себе на службу еще быстрее эволюционирующие вирусы, человечество сможет как минимум на равных участвовать в эволюционной гонке вооружений с насекомыми-фитофагами. Вероятно, теперь производство ГМ-растений с новыми инсектицидными белками можно будет поставить на поток, что позволит значительно увеличить производительность сельского хозяйства в глобальном масштабе. Учитывая, что население Земли уже в середине нынешнего века приблизится к отметке 10 миллиардов, значение новой технологии трудно переоценить.
Источник: Ahmed H. Badran, Victor M. Guzov, Qing Huai, Melissa M. Kemp, Prashanth Vishwanath, Wendy Kain, Autumn M. Nance, Artem Evdokimov, Farhad Moshiri, Keith H. Turner, Ping Wang, Thomas Malvar & David R. Liu. Continuous evolution of Bacillus thuringiensis toxins overcomes insect resistance // Nature. 2016. V. 533. P. 58–63.
См. также:
1) Трансгенный хлопок помог китайским крестьянам победить опасного вредителя, «Элементы», 20.09.2008.
2) Насекомые-вредители защищаются от биологического оружия, «Элементы», 08.10.2007.
3) В. В. Чуб. Растения-ГМО.
4) А. Ю. Панчин. ГМО — мифические опасности.
Александр Марков
Амазахи — белый север Африки 
Как нарастить ресницы самостоятельно – инструкция